Природа против рака
Апигенин в самых больших количествах содержится в сушеной петрушке и представляет собой нетоксический диетический флавоноид. Его свойства и широкое воздействие рассматривается учеными, как потенциальное противовоспалительное, антиоксидантное и противоопухолевое средство.
ИССЛЕДОВАНИЕ (перевод автоматический без адаптации)
Авторы: ученые нескольких медицинских институтов Тайваня
Дата: март 2015
Источник: www.ncbi.nlm.nih.gov
Фон
Апигенин является нетоксичным диетических флавоноидов, и это может иметь препараты для химиопрофилактики и терапевтический потенциал как противовоспалительное, антиоксидантное и противоопухолевое средство. Однако, ее роль при раке мочевого пузыря остается недостаточно изученным. Целью данного исследования явилось изучение анти-пролиферативной активности апигенин в человека рак мочевого пузыря Т-24 клетки.
Методы и результаты
Апигенин ингибирует Т-24 пролиферацию клеток доза-зависимым образом. Мы показали, что апигенин-индуцированной начале и середине апоптотических клеток могут быть идентифицированы по Annexnin с V-Алекса корпорация fluor 488/ИП выявление апоптоза и tunel-теста. Кроме того, с помощью ЙК-1 окрашивание анализа, мы обнаружили, что апигенин может вызвать потеря митохондриального мембранного потенциала. Выполняя проточной цитометрии и Вестерн-блоттинга, апигенин-опосредованной subG1 acculmulation этап был связан также с увеличением фосфо-р53, р53, р21, р27 и уровней, и с уменьшением Циклин а, Циклин В1 и Циклин Е, CDK2, Cdc2, и Cdc25C уровнях, тем самым блокируя клеточный цикл прогрессии. ИФА показал, что subG1 фазы acculmulation было обусловлено увеличением р53, р21, р27 и уровней. Кроме того, апигенин увеличил Бакс, плохие, и бак уровнях, но сократили и bcl-хl, белок bcl-2, и mcl-1 уровнях, и впоследствии срабатывает митохондриального пути апоптоза (высвобождение цитохрома С и активацию каспазы-9, каспазы-3, каспазы-7, и ПАРП). Дальнейший анализ показал, что апигенин увеличили уровня АФК в ГШ и истощенных Т-24 клетки на 12 сек.
Выводы
Полученные результаты позволили предположить, что апигенин ингибирует Т-24 пролиферацию клеток через блокирование клеточного цикла прогрессии и индуцируя апоптоз. Кроме того, мы обнаружили потенциальную противораковую активность апигенин против Т-24 клетки.
Введение
Рак мочевого пузыря занимает второе место по частоте злокачественная опухоль мочеполового тракта и ассоциируется со значительной заболеваемостью и смертностью [1]. Хотя большинство случаев рака мочевого пузыря являются поверхностными, со времени установления диагноза, в том числе хирургии, внутрипузырная химиотерапия, лучевая/терапия иммунотерапия и системная химиотерапия. Тем не менее, рак мочевого пузыря связан с плохим прогнозом, поскольку он обладает высокой устойчивостью к радиации и химиопрепаратов. Кроме того, больных с распространенным раком мочевого пузыря 5-летняя выживаемость примерно 20-40% несмотря на различные способы лечения [2-4]. Поэтому роман и эффективных терапевтических стратегий для лечения передовых рака мочевого пузыря срочно требуется. Человека мочевом пузыре опухоли, как известно, развивается по 2 основных и независимых биологических осей, каждая из которых представила многообразных дискретных генетических изменений контроллинга инициации и прогрессии опухоли [5,6]. Сложность молекулярных путей, участвующих в рак мочевого пузыря стадия, в сочетании с различных генетических и эпигенетических событий, происходящих в ходе опухолевой прогрессии, несут основную ответственность за глубокое гетерогенности этого заболевания [7,8].
Апоптоз играет важную роль в гомеостазе и развитии тканей в многоклеточных организмах [9]. Биохимические события приводят к изменения морфологии клеток и смерти. Дисбаланс между клеточной пролиферации и апоптотической гибели клеток результаты в критических заболеваний, таких как рак [9,10]. Во многих клеточных моделях, в режиме смерти произведенные посвящение стимул может быть переключен путем ингибирования контрольных точек или крупных исполнения шагов в смерти тропа, таких как активация каспазы, цитохром с - релиз, или активных форм кислорода (АФК) поколения [11-13]. В последние годы научный интерес в митохондрию, которая играет жизненно важную роль в гибели клеток процессов. Несколько стрессоров, таких как воспаление, излучение (ультрафиолетовое или рентгеновское излучение), тяжелых металлов, лекарств, тепловой шок, и подкисления, являются индукторами апоптоза, и они участвуют в открытии перехода поровой проницаемости, увеличение Бакс/Бпп-2 коэффициент, и генерацию АФК из митохондрий, которая может вызвать высвобождение apoptogenic факторов [14]. Кроме того, внутриклеточного восстановленного глутатиона (GSH) содержание оказывает решающее влияние на противоопухолевый препарат-индуцированного апоптоза, указывая, что антиапоптотический эффекты обратно пропорциональны ГШ содержание [15,16].
Множественные генетические изменения, происходящие в процессе канцерогенеза причиной клеточной аномалии. Последние достижения в области клеточной биологии показали детальные механизмы клеточного цикла регуляторных систем и показали, что усиление пролиферации является общей характеристикой в многочисленных раковых заболеваний [17,18]. Клеточный цикл прогрессии предполагает последовательную активацию CDKs, активация которых зависит от ассоциации с циклинами. Поэтому эукариотические клетки разработали эффективный и хорошо отрегулированных механизмов контроля клеточного цикла прогрессии [19].
Повышенное потребление фруктов и овощей связано со снижением риска некоторых видов рака [20]. Апигенин (4',5,7,-trihydroxyflavone) является распространенным диетических флавоноидов и широко распространен во многих фруктах и овощах, таких как петрушка, лук, апельсины, и чай [21]. Естественным апигенин встречается большей частью в виде гидроксилированных, и было продемонстрировано, чтобы ингибировать опухолевую пролиферацию, подвижность, ангиогенез и апоптоз [22-25]. Хотя различные исследования показали, что апигенин обладает противоопухолевыми свойствами, механизмы, лежащие в основе его противоопухолевой активности остаются неизвестными. В данном исследовании мы использовали человеческий рак мочевого пузыря Т-24 клеточных линий, чтобы понять молекулярные механизмы, ответственные за антипролиферативного эффекта апигенин. Мы показали, что апигенин ингибирует Т-24 пролиферацию клеток через блокирование клеточного цикла прогрессии и индуцируя апоптоз.
Материал и методы
Реактивы и антитела
Апигенин (чистота≧99%) был приобретен у Extrasynthese (Genay, Франция); диметилсульфоксид (ДМСО), додецилсульфата натрия (СДС), phenylmethylsulfonyl фтор, и альбумин бычьей сыворотки (BSA) были приобретены от Sigma-Олдрич химической Co. (Сент-Луис, Миссури, США); на Аннексин V для-Алекса корпорация fluor 488 и пропидия йодида (ПИ) набор для обнаружения апоптоза были приобретены от Invitrogen (молекулярный зонд, МКП, Юджин, Орегон, США). Белка пробирного комплект был получен от ООО " Био-рад лаборатории. (Геркулес, Калифорния, США). Питательная среда в фосфатно-буферный солевой раствор (ФБС), а трипсин-ЭДТА были приобретены у Gibco-BRL (на Гейтерсберге, штат Мэриленд, США). Мышь или кролик-моноклональных антител, специфичных для цитохром с, каспазу-3, каспазу-7, каспазу-9, Циклин В1 и Циклин e и CDK2 были приобретены из Санта-Крус биотехнологии (Санта-Круз, Калифорния, США). Мышь или кролик-моноклональных антител, специфичных для фосфо-р53, р53, р21, р27, белок bcl-2, белок bcl-хl, мкл-1, Бакс, Бад, бак, поли( АДФ-рибоза) - полимеразы (ПАРП), Cdc2, Cdc25C, и Циклин а были приобретены у корпорации Invitrogen (Камарильо, Калифорния, США). β-Актин антител был куплен из БД Трансдукции лабораторий (Сан-Диего, Калифорния, США). Усиленной хемилюминесценции (ЭХЛ) комплект был куплен от Амершам науки о жизни (включая Амершам, Великобритания).
Культура клеток и апигенин лечение
Человека доброкачественных легочных фибробластов клеточной линии и Wi-38 и мочевого пузыря карцинома клетки линии НТ-1376 поддерживались в mem среде. Карциномы мочевого пузыря человека клеточной линии Т-24 была выдержана в Маккоя 5А среды. Карцинома предстательной железы человека клеточной линии РС-3 сохранялся в Хама F12K среднего. Вышеупомянутые клеточные линии были получены из РЦБК (Биоресурсного коллекции и научный центр, Син-Чу, Тайвань). Все клетки культивировали при 37°C в увлажненной атмосфере 5% со2-95% воздуха. В среде с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков (100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина). Прилипшие клетки, выделенные путем инкубации с трипсином. Для лечения апигенин, апигенин фондового растворе растворяли в ДМСО и стерилизуют фильтрованием через 0.2 мкм фильтры диска. Соответствующих сумм из маточного раствора (1 мг/мл в ДМСО) из апигенин были добавлены к культуральной среде для достижения указанных концентрациях (финальная концентрация ДМСО была < 0.2%).
Жизнеспособность клеток
Для того чтобы измерить эффект апигенин на жизнеспособность клеток, модуль Wi-38, Т-24, НТ-1376 и PC-3 клетки высаживали в 24-луночные планшеты (1 × 105 клеток/лунку) в течение 16-18 ч. Клетки были затем обработаны с или без различных концентрациях (0, 1, 5, 10, 20, 30, 40, и 50 мкг/мл) апигенин (24 ч). Каждая процедура была повторена 3 раза. После периода воздействия, среды удаляли и последующей промывкой клеток с pbs. Средний был затем изменен и инкубировали с 3-(4,5-dimethylthiazol-2-ил)-2,5-diphenyltetrazolium бромид (МТТ) раствор (5 мг/мл)/ну за 4 сек. Среда была удалена, и формазана было солюбилизированных в изопропаноле и измеряется спектрофотометрически при 563 нм. Процент жизнеспособных клеток оценивалась путем их сравнения с необработанной контрольной клетки.
Клетки-цикл опробования
Цитометрический анализ Т-24 клеток проводили с использованием проточного цитометра FACScan (Бектон Дикинсон Immunocytometry систем, Великобритании). Анализ распределения клеточного цикла, клетки были изначально получавших различные концентрации (0, 1, 5, 10, 20, 30, и 40 мкг/мл) апигенин в течение 24 ч, и затем были собраны trypsinisation, фиксированной в 75% абсолютного этанола, промывали в pbs и ресуспендируют в 1 мл ФБС, содержащего 0,5 мг/мл Рнказы A и 0.01 мг/мл Pi в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. Клеточный цикл обзоров были проанализированы с помощью с помощью проточного цитометра. Процент клеток в суб-G1, в g0 в/Г1, S и G2/M фазах клеточного цикла была проанализирована с использованием ModFit ЛТ 3.0 программного обеспечения (программное обеспечение Верити, них, меня, США).
Аннексин V с-Алекса корпорация fluor 488 и ПИ апоптоза обнаружения пробирного
Количественную оценку апоптоза проводили с использованием Аннексина V-в версии Alexa 488 муки и ПИ обнаружения апоптоза комплект. Кратко, клетки высевали в 6-луночные планшеты, выращивают в течение 16-18 ч и обрабатывают апигенин (0, 20 и 30 мкг/мл) в течение указанного времени. После периода воздействия, среды удаляли, и клетки промывали с CA2+и MG2+- бесплатный ПБС. Клетки были затем крепить с помощью 4% параформальдегида в CA2+и MG2+-бесплатный pbs в течение 15 мин. Кроме того, клетки были затем промывают аннексин-связывающего буфера [20 мм 4-(2-гидроксиэтил)-1-piperazineethanesulfonic кислоты (HEPES), 700 мм NaCl, 12,5 мм аттестации и лицензированию аудиторов2, рН 7,4] и окрашивали Аннексин V с-Алекса корпорация fluor 488 и ПИ в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. Затем мы наблюдали клетки под флуоресцентным микроскопом с использованием двойной фильтрации комплект для флуоресцеина изотиоцианатом (FITC) и родамина (BX51, Олимп, Токио, Япония). Апоптотические клетки определялись как Аннексин V с-Корпорация fluor 488 или Alexa-позитивные и Pi-негативные клетки. Наше определение клеточного сложилась следующая ситуация: неокрашенные клетки были классифицированы как "жить", для окрашенных клеток Аннексин V с-Алекса корпорация fluor 488 были только на раннем этапе апоптоза’, клетки окрашивали для обоих Аннексин V с-Алекса корпорация fluor 488 и ПИ были ‘позднего апоптоза’, и клетки окрашивали для ПИ только были ‘мертвыми’. Апоптотических клеток были суммы ранних и поздних апоптотических клеток.
ТУНЕЛЬ пробирного
Нами был применен количественный метод оценки, выполняя терминал deoxynucleotidyl трансферазы-опосредованной дезоксиуридина трифосфат ник конце маркировки (ТУНЕЛЬ) метод, чтобы исследовать разрывы ДНК в ходе апоптоза. Вкратце, клетки высевали в 6-луночные планшеты и обрабатывали различными концентрациями (0, 5, 10, 20, 30, и 40 мкг/мл) апигенин за 6 сек. После периода воздействия, среды удаляли, и клетки затем промывают с CA2+и MG2+- бесплатный ПБС. Клетки фиксировались 4% параформальдегида и permeabilised с 0.1% Тритон х-100 в 0,1% цитрата натрия. После промывки клетки инкубировали в реакционной смеси, представленной в объектив APO-brdu клетокТМ ТУНЕЛЬ пробирного комплект (молекулярный зонд, Инк). В апоптотических клеток с фрагментированной ДНК хромосомные концы были помечены с ТДТ, которые выставлены бисера-вроде зеленого свечения под люминесцентным микроскопом при 20-кратном увеличении.
Митохондриальная-мембранный потенциал пробирного
Мы использовали митохондриальную-специфический катионный краситель ЙК-1 (5,5',6,6'-тетрахлор-1,1',3,3'- тетраэтил-benzimidazolylcarbocyanine йодид) (молекулярный зонд, Инк), который подвергается потенциал-зависимого накопления в митохондриях. ЖС-1 избирательно накапливается в интактных митохондриях в виде multimer J-агрегатов, излучающих свет флуоресценции при 590 нм (красный) на более высоком мембранном потенциале, и мономерный ЖС-1 флуоресценция испускает свет при 527 нм (зеленый) по низкой мембранного потенциала. Клетки высевали в 6-луночные планшеты и обрабатывали 0-30 мкг/мл апигенин в течение 3 и 24 ч.После периода воздействия, среды удаляли, и клетки промывали Калифорния2+и MG2+-бесплатный ПБС. Клетки были затем окрашивали 10 мкг/мл ЖС-1 в течение 30 мин при 37°С и исследовали под люминесцентным микроскопом. Таким образом, сигнал флуоресценции были обнаружены по цвету излучаемого света по ЖС-1 указывают на митохондрии мембранного потенциала, которые могут быть проанализированы с помощью люминесцентного микроскопа оснащен двойной полосовой фильтр (обнаруживает FITC и родамина). Исходя из результатов, мы отсортированных клеток как здоровых клеток и апоптотических клеток. В здоровых клетках, краситель накапливается в митохондриях и агрегатов, излучающих ярко-красной флюоресценции.В апоптотических клетках, краситель не сможет агрегировать в митохондриях из-за измененной митохондриального мембранного потенциала, и таким образом он остается в цитоплазме (мономерной формы) и испускает зеленую флуоресценцию.
Подготовка всей-клеточные лизаты и Вестерн-блоттинга пробирного
Клетки были проанализированы с холодного-холодного radioimmunoprecipitation анализа (рипа) буфера (1% НП-40, 50 мм Трис-основания, 0.1% СДС, 0.5% дезоксихолевой кислоты, 150 мм NaCl, рН 7,5) и затем phenylmethylsulfonyl фтор (10 мг/мл), leupeptin (17 мг/мл), и orthovanadate натрия (10 мг/мл) были добавлены. После вортексе на льду в течение 30 мин. образцы центрифугировали при 12000 × G в течение 10 мин, а затем в супернатантах были собраны, денатурированные, и подвергнут додецилсульфатом натрия-полиакриламидный гель электрофорез (SDS-пааг) и Вестерн-блоттинга. Содержание белка определяли, используя Био-рад белок пробирных реактивов с БСА в качестве стандарта. Мы выступали регуляторами ecl Вестерн-блоттинга было следующим образом. Белки были решены на 10-12% SDS-пааг гели и затем переносят на нитроцеллюлозные мембраны. Неспецифическое связывание мембран был заблокирован с Трис-буферным раствором (столовая ложка), содержащий 1% (Вес/объем) обезжиренного сухого молока и 0,1% (об/об) Твина-20 (TBST) в течение более чем 2 сек. Мембраны промывали TBST 3 раза по 10 мин и инкубировали с соответствующим разбавлением специфических первичных антител в TBST ночь при 4°C. Затем мембраны промывали TBST и инкубировали с соответствующим вторичным антителом (конъюгированных с пероксидазой корня хрена козьего или antirabbit antimouse IgG в) в течение 1 сек. После мембраны промывали 3 раза по 10 мин в TBST, полосы были обнаружены с помощью усиленной хемилюминесценции с помощью ЭСЛ Вестерн-блоттинга для обнаружения реагентов и открытыми ЭСЛ hyperfilm в Fujifilm Лас-3000 мини-системы визуализации (Токио, Япония). Белки были затем количественно определяли путем денситометрии с помощью камеры Fujifilm-Мульти Датчик В3.0 программного обеспечения.
Измерения р53, р21, р27 и уровней
Внутриклеточные уровни уровни р53, р21 и р27 определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Вкратце, Т-24 клетки высевали в 5-см посуду и выращивают до 85-90% слияния, и затем обрабатывают 0, 20 и 30 мкг/мл апигенин для 6, 12, 24, и 48 сек. Клеточные лизаты помещали в 96-луночные микротитровальные пластины (1 × 106 на одну скважину), покрытые моноклональными антителами детектив, и затем инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. После несвязанные антитела удаляли путем промывки раствором промывочного буфера (50 мм Трис, 200 мм NaCl, и 0,2% Твин-20), на обнаружение антител, который связывается с помощью конъюгированных с пероксидазой корня хрена стрептавидин, был добавлен для связывания с антителами. Пероксидазы катализировать превращение хромогенного субстрата (тетраметилбензидин) в цветной раствор с интенсивность окраски пропорциональна уровень белка, содержащегося в образце. Поглощение каждой лунки измеряли при 450 нм, и р53, р21, р27 и уровни определялись путем интерполяции из стандартных кривых, полученных с известными уровнями стандартных белков. Данные выражены как PG р53, р21, р27 или уровней (ПГ/106клеток).
Измерение внутриклеточного уровня АФК
Внутриклеточных АФК оценивали с помощью флуоресцентного зонда 2',7'-дихлорофлуоресцеина (dichlorofluorescein) диацетат (DCFH-Da и). DCFH-Da и легко диффундирует через клеточные мембраны и является ферментативно гидролизуют с помощью внутриклеточных эстераз для люминесцентных dichlorofluorescin (DCFH), который затем быстро окисляется в сильно флуоресцирующий ФСР в присутствии АФК. Кратко, клетки обрабатывали 30 мкг/мл апигенин для различных периодов (0, 1, 2, 3, 6, и 12 сек). Т-24 клетки (1 × 105 клеток/мл) были затем инкубировали в культуральной среде, содержащей 20 мкм DCFH-Da в течение 30 мин при 37°С и промывали в pbs. В суспензию клеток центрифугировали в 412 × G в течение 10 мин и среда была удалена. Клетки были распущены с 1% Тритон х-100, и DCF интенсивности флуоресценции была обнаружена на различных временных интервалах при возбуждении длиной волны 503 нм и эмиссионной длине волны 529 нм, используя FLUOstar Оптима spectrofluorophotometer. ФСР интенсивности флуоресценции пропорциональна внутриклеточного уровня АФК [26].
Измерение внутриклеточного уровня ГШ
Внутриклеточный уровень ГШ были измерены с использованием метода Hissin и Hilf [27]. После обработки клетки промывали pbs и разделан на металл в 6.5% трихлоруксусной кислоты. Фосфат-ЭДТА буфера (4,5 мл) при pH 8,0 и добавляли к 0,5 мл надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования при 12000 ч G. Окончательный анализируемой смеси (2 мл) содержится 100 мкл разведенного супернатанта, 1.8 мл фосфат-ЭДТА буфере (рН 8,0) и 100 мкл 0.1% о-phthalaldehyde решение. После тщательного перемешивания и инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин, флуоресценции было прочитать на длинах волн 350 нм (возбуждение) и 420 нм (эмиссия), используя FLUOstar Оптима spectrofluorophotometer.Редуцированная форма ГШ был использован в качестве стандарта. Данные выражаются в виде nanomole ГШ за 106 ячеек.
Статистический анализ
Данные выражены как означает ± стандартное отклонение из 3 независимых экспериментов и проанализированы с использованием Студенческий т-тест (2001 Sigmaplot, SPSS Инк, Чикаго, Иллинойс, США). Р значения <0.05 считались статистически значимыми.
Результаты
Апигенин ингибирует Т-24 пролиферации клеток
Химическая структура апигенин иллюстрируется на рис. 1А. изучение влияния апигенин на жизнеспособность клеток в четырех клеточных линиях (Висконсин-38, Т-24, НТ-1376 и ПК-3), на жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-теста. Результаты показали, что апигенин снижается жизнеспособность этих трех линий клеток, Т-24, НТ-1376, и ПК-3 доза-зависимым образом (рис. 1Б). Особенность, СК50 значения апигенин были 23.6, 35.2, и 40.2 мкг/мл для T-24, НТ-1376, и PC-3 клеток на 24 ч, соответственно. Среди этих клеток, Т-24 клетки были гораздо более чувствительны к апигенин по сравнению с другими клеточными линиями. Кроме того, сильнейшие потенции апигенин на цитотоксичностью раковых клеток в сторону Т-24 мочевого пузыря раковых клеток, поэтому, мы выбрали Т-24 клеточных линий для последующих экспериментов. Апигенин не имел цитотоксическое действие towardsWI-38 клетки (рис. 1В).
Апигенин индуцированного клеточного цикла и апоптоза В Т-клетках 24
Для тестирования базового механизма, что приводит к апигенин-индуцированной потере клеточной пролиферации, мы наблюдали последствия апигенин на Т-24 клетки, обнаруживая эффект апоптоза и клеточного цикла прогрессии. Кратко, Т-24 клетки были обработаны 0, 1, 5, 10, 20, 30, и 40 мкг/мл апигенин в течение 24 ч и подвергали проточной цитометрии. Клетки обрабатывали апигенин (0-40 мкг/мл) в течение 24 ч, явное скопление клеток в суб-G1 фазе (в фазе гиподиплоид, также названный subG1 фаза) с 6,2% до 78,5% наблюдалось (Рис. 2А). В subG1 фазы повышенной (более 50%), когда клетки обрабатывали 20-40 мкг/мл апигенин. Кроме того, апигенин лечения значительно снижается доля клеток в G2/М фазе. Никаких изменений в s-фазе наблюдалось. Таким образом, эти результаты показали, что апигенин ингибирует Т-24 пролиферации клеток.
Впоследствии, мы оценивали эффект апигенин на индукцию апоптоза В Т-24 клетки, выполняя Аннексин V с-Алекса корпорация fluor 488/ИП ТУНЕЛЬ и пробирного анализов. Во-первых, Аннексин V с-Алекса корпорация fluor 488/Pi двойная-техника окрашивания была выполнена расследовать ли апигенин индуцированной раннего апоптоза В Т-24 клетки. Процент Т-24 клетки, проходящие ранней апоптотической гибели клеток был увеличен на апигенин в зависимости от дозы и зависимым от времени образом (Рис. 2Б). Для дальнейшего подтверждения апигенин-индуцированного апоптоза, а ТУНЕЛЬ анализ проводили для выявления ДНК-разрывов нити. Результаты анализа показали, что облучение Т-клеток к 24 5-40 мкг/мл апигенин в течение 6 ч, привело к значительному росту флуоресцеина окрашенных ядер по сравнению с необработанной контрольной ячейки (Рис. 2В).
Апигенин-индуцированная потеря митохондриального мембранного потенциала и высвобождением цитохрома С В Т-24 ячейки
Потеря митохондриального мембранного потенциала является ранним событием в апоптозе. Поэтому мы оценили влияние лечения на апигенин митохондриального мембранного потенциала (△Ψм), используя флуоресцентный микроскоп и jc-1 флуоресцентный краситель. Как показано на рис. 3А, когда Т-24 клетки инкубировали с 0-40 мкг/мл апигенин в течение 3 и 24 ч, интенсивность красной флуоресценции уменьшилась, а выросла зеленая флуоресценция в цитоплазме с увеличением апигенин уровне. Еще одним свидетельством потеря митохондриального мембранного потенциала были более очевидны в высокой дозе (20 и 30 мкг/мл) апигенин-обработанных клеток, наоборот, когда Т-24 клетки обрабатывали 5 и 10 мкг/мл апигенин в течение 3 и 24 ч, никаких изменений не наблюдалось в митохондриальный мембранный потенциал (данные не показаны). Кроме того, Т-24 клетки инкубировали с 20 и 30 мкг/мл апигенин в течение 24 ч привело к резкому сокращению митохондриального мембранного потенциала примерно на 50% и 85% соответственно. Нарушение митохондриальной мембраны приводит к высвобождению цитохрома С из митохондрий в цитозоль; следовательно, цитохрома сможет быть обнаружен с помощью Вестерн-блоттинга. Наши результаты показали, что апигенин лечении Т-24 клеток ведет к высвобождению цитохрома С из митохондрий в доза-зависимым образом (рис. 3Б).
Апигенин индуцированной апоптотической смерти через митохондриального пути апоптоза В Т-клетках 24
Мы исследовали, является ли апигенин подавляет жизнеспособность Т-24 клетки и способствует фрагментации ДНК в таких клетках через активацию митохондриального (внутреннего) пути апоптоза. Для определения митохондриальных апоптотических событий, участвующих в апигенин-индуцированного апоптоза, мы сначала проанализировали изменения уровней проапоптотических белков Вах, плохо, и бак, и антиапоптотических белков и bcl-хl, белок bcl-2, и mcl-1. Результаты показали, что апигенин лечения Т-клеток увеличилось на 24 бакса, плохо, и бак уровни белка. Напротив, апигенин снизилась по bcl-хl, белок bcl-2, и mcl-1 белка (Рис. 4А).
Активация протеаз цистеина, которые являются инициаторами и исполнителями клеточной гибели, является отличительным признаком апоптоза [28]. Результаты показали, что апигенин значительно активировать каспазу-3, каспазу-7, и каспазы-9 и индуцированных отмечены расщепление ПАРП в клетках Т24 (Рис. 4Б).
Апигенин влияние на экспрессию клеточного цикла-белки, связанные с
Определить путь, участвующие в апигенин-индуцированная остановка клеточного цикла в Т-24 клетки, в серии экспериментов были исследованы в которой воздействие на апигенин, регулирующих клеточный цикл молекулы. Во-первых, мы измеряли экспрессию белка и статуса фосфорилирования р53 с помощью elisa и Вестерн-блоттинга. Белковой экспрессии и статуса фосфорилирования р53 значительно увеличилась в раз-зависимый характер после лечения с 30 мкг/мл апигенин (Рис. 5A и D). Кроме того, ингибиторы ЦИКЛИН р21 и р27 были вовлечены в арест клеточного цикла. Таким образом, мы рассмотрели влияния апигенин на р21 и р27 белка. Результаты неожиданно указала увеличивается в р21 и р27 белка через 24 ч, достигая максимума через 48 ч зависимым от времени образом (Рис. 5B и C). Мы пришли к выводу, что апигенин-индуцированного клеточного цикла было связано с индукцией в уровень белка р53 и р53 phosphoryaltion, что впоследствии модулированных р21 и р27 белка. Кроме того, мы также оценивали эффект лечения апигенин на Циклин а, Циклин В1 и Циклин Е, CDK2, Cdc2, и Cdc25C белка, которые являются регуляторами клеточных циклов. Наши результаты показали, что лечение с 30 мкг/мл апигенин сократили Циклин а, Циклин В1 и Циклин Е, CDK2, Cdc2, и Cdc25C уровни протеина в зависимости от времени и типа клеток образом в Т24 (Рис. 5д).
Последствия апигенин на внутриклеточный уровень АФК в ГШ и т-24 ячейки
Несколько докладов предполагают, что АФК выступают перед каспазы-3 в активацию пути передачи сигнала, и таким образом привести к апоптозу. Кроме того, окислительные реакции в митохондриях в результате Роси поколения, которые преобразуются в H2o и2 по супероксиддисмутазы. В неферментативного глутатион (γ-глу-СМУ-гли) является наиболее эффективным антиоксидантом, который предотвращает Рось поколения. Истощение ГШ связана с апоптотической гибели клеток машин [29]. Как показано на рис. 6А, апигенин индуцированное повышение внутриклеточного рос в такое время-зависимый характер. Одним из следствий рос поколение нейтрализации свободных радикалов по ГШ. Внутриклеточный уровень ГШ были измерены в апигенин-обработанные Т-24 клетки в различные моменты времени. ГШ уровни были раз-зависимо снизилась в апигенин - обработанные Т-24 клетки (рис. 6Б).
Обсуждение
Рак мочевого пузыря является вторым наиболее распространенным видом рака мочеполовой тракт. Недавние исследования показали, что еда соединений (фитохимические соединения), которые могут иметь решающее значение антиканцерогенное деятельности. Препараты для химиопрофилактики фитохимические вещества может подавлять и задерживать инициацию или обратить вспять продвижение стадии в многостадийном канцерогенезе. Они могут блокировать прогрессирование рака с помощью различных механизмов, в том числе действующей в качестве антипролиферативных агентов и антиоксидантов. Некоторые фрукты и овощи обладают разнообразными фармакологическими свойствами и являются богатым источником фитохимических веществ с антиканцерогенным потенциалом [30,31].
Флавоноиды являются биологически активные фитохимические вещества, которые широко распространены в растениях и способны быть поглощенным без предшествующего гидролиза желудочно-кишечного тракта. Они повсеместно содержатся во фруктах, овощах, чай, и вино, и как завод вторичных метаболитов [32-34]. В течение последнего десятилетия, многочисленные исследования показали, что флавоноиды и их метаболиты имеют различные Фармакологические свойства. Флавоноиды имеют костяк 2-phenylchromen-4-один (2-фенил-1-benzopyran-4-один). Недавние исследования показали, что апигенин может усилить противораковый эффекты против ультрафиолета в (UVB)- и бенз(а)пирена (Бап)-индуцированных кожных опухолей и митохондриальной дисфункции у мышей. Данные о канцерогенезе кожи у мышей показали, что предварительная обработка с апигенин значительно подавляет УФ-индуцированных опухолей кожи заболеваемость [35]. Поэтому, гликозид флавоноид апигенин-это форма, которая имеет физиологические преимущества при их употреблении в натуральном виде еды. Жизнеспособность клеток была анализировали в культурах, подверженных 0-50 мкм в течение 24 ч апигенин, апигенин и демонстрировали дозозависимое ингибирующее действие на рост Т-24, НТ-1376, и PC-3 клетки. По сравнению с другими раковых клеточных линий, апигенин оказывает более эффективное ингибирующее действие на рост Т-24 (человеческих клетках карциномы мочевого пузыря). Тем не менее, Wi-38 (человеческого доброкачественных легочных фибробластов клетки) был менее чувствителен к ингибирующий рост эффект апигенин, чем другие раковые клетки, указывая, что опухолевые клетки более чувствительны к апигенин лечения. Одним из основных критериев для потенциальных противоопухолевых препаратов является способность избирательно убить опухолевые клетки, но не нормальные клетки. Кроме того, наши представления данных выявили апигенин лечение привело к дозо-зависимое накопление Т-24 клеток в суб-G1 фазе одновременно со снижением в G2/М фазе. Никаких изменений в s фазе не наблюдалось. Наши наблюдения схожи исследование piceatannol, природный полифенол, присутствующий в винограде и вине. В этом исследовании, piceatannol уменьшились накопления человеческого Т-24 и HT1376 мочевого пузыря раковые клетки в G2/М фазе клеточного цикла [36].
Требуется проведение дальнейших исследований о связи между арестом G1 фазе и р-р53, р53, р27 и р21 и по влиянию на апигенин циклинами, CDKs, Cdc2, и Cdc25C, который связывается с циклинами и CDKs, которые регулируют клеточный цикл прогрессии в ответ на апигенин лечения. Опухолевого Гена-супрессора р53 хорошо известно, играют решающую роль в индукции апоптоза и клеточного цикла после повреждения ДНК или клеточный стресс в клетках человека [37]. Кроме того, р53 считается действуя как привратник для клеточного роста и деления, контролируя критические клеточного цикла контрольно-пропускные пункты. р53 опосредует апоптоз путем активации АПО (APO-1/FAS и другие рецепторы смерти по регулируя и downregulating Вах и bcl-2, соответственно. р53 также участвует в митохондриальной генерацию АФК из митохондрий, которая может стать причиной выхода апоптотических факторов. р21 и р27 белки подавляют деятельность различных циклин-зависимых киназ, тем самым блокируя G1 к s фазе перехода в клеточном цикле [38]. Предыдущие исследования показали, что р21 и р27 являются transcriptionally регулируется р53-зависимый и р53-независимому пути [39]. Наши результаты показали, что апигенин лечении Т-24 клеток приводит к увеличению р-р53, р53, р21, р27 и уровней. Следовательно, мы предполагаем, что блокада клеточного цикла прогрессии было вызвано увеличением р21 и р27 белка, тем самым ингибируя Т-24 пролиферации клеток. Эукариот клеточный цикл прогрессии предполагает последовательную активацию CDKs, активация которых зависит от их ассоциации с циклинами. В нашем исследовании мы показали, что апигенин снизилось Циклин а, Циклин В1 и Циклин Е, CDK2, Cdc2, и Cdc25C уровнем белка, в то время как она увеличилась на р21, р27, р53 и с-белка р53 уровнях.
Митохондриального пути апоптоза считается одной из основных сигнальных путей апоптотической клеточной гибели в клетках млекопитающих. Митохондриальный мембранный потенциал (△Ψм) часто уменьшается в апоптоз. Это снижение △Ψм опосредовано открытие поры перехода проницаемости [40]. Кроме того, переноса электронов и окислительного фосфорилирования нарушается и АФК часто накапливаются в процессе апоптоза, что свидетельствует о дисфункции митохондрий. Генерируемые АФК относятся супероксид-анион радикала (.О2−), гидроксильный радикал (.Огайо), перекись водорода (Н2О2) и пероксинитрита (ONOO−) [41]. На генерацию АФК и в результате окислительного стресса вовлечены как гибель клеток инициация сигналов, которые способствуют митохондриальной дисфункции (например, снижение △Ψм). В неферментативного глутатион (с-глю-СМУ-гли) является наиболее эффективным антиоксидантом, который предотвращает Рось поколения. Истощение ГШ связана с апоптотической гибели клеток механизма, поскольку снижение уровня GSH и сопутствующего увеличения АФК в процессе апоптоза сообщалось [29]. Наши исследования показали, что апигенин заблокирован клеточного цикла прогрессии и индуцированной поздней гибели клеток в раковые клетки с помощью внутреннего пути снижения уровня GSH через чрезмерное накопление внутриклеточных АФК.
Кроме того, функции митохондрий регулируется членов и bcl-2 семейства, включающих антиапоптотических белков (белок bcl-2, белок bcl-XL, и мкл-1) и проапоптотических белков (Вах, Bad и бак), которые контролируют проницаемость митохондриальной мембраны и играют важную роль в сущностной пути апоптоза [42]. Апигенин после лечения Т-24 клетки, мы наблюдали достоверное увеличение экспрессии белка bax, Bad и бак, и уменьшение экспрессия bcl-2, белок bcl-XL, и мкл-1. Эти данные позволяют предположить, что изменения в соотношении проапоптотических и антиапоптотических белков Всl-2 семьи может способствовать апоптозу-содействие деятельности апигенин. Кроме того, наши результаты показали, что апигенин лечении Т-24 клетки уменьшает △Ψм и активирует каспазы-9, каспазы-3 и каспазы-7. Кроме того, каспазы-3 приводит к активации расщепления целого ряда белков, в том числе ПАРП. Расщепление ПАРП является основным показателем апоптоза. Эта полимераза является ядерная ДНК-связывающих цинковые пальцы " белка, что играет роль в репарации ДНК и в других клеточных процессов, включая клеточную пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [43]. Соответствует этот вывод, апигенин-индуцированного апоптоза, который включает митохондриальных апоптотических событий, был связан с модуляцией по bcl-2 семейство белков, апигенин. Эти результаты подтверждают участие каспаз апоптоза в ответ на апигенин В Т-24 клетки, и это участие было подтверждено иммунологическими обнаружение 116 кда нетронутыми ПАРП и внешний вид своего 85 кда фрагмент, соответствующий продукт, выпущенный на активацию каспазы.
В резюме, в настоящем исследовании результаты показали, что (1) человеческого рака мочевого пузыря Т-24 клетки очень чувствительны к торможение роста по апигенин; (2) апигенин может блокировать клеточный цикл прогрессии в subG1 фазы, тем самым ингибируя Т-24 пролиферации клеток; (3) апигенин может ингибировать клеточный цикл прогрессии с участием р53 повышенная, увеличить выражений р21 и р27, и уменьшить экспрессию Циклин а, Циклин В1 и Циклин Е, CDK2, Cdc2, и Cdc25C; (4) апигенин вызывает митохондриального пути апоптоза путем регулирования экспрессия bcl-2 семейство белков, вызывая высвобождение цитохром Си активации каспазы-9, каспазы-7, каспазу-3, и ПАРП. Эти результаты показывают, что апигенин может быть эффективные препараты для химиопрофилактики агента при раке мочевого пузыря.
Признание
Эта работа была поддержана грантом программы исследований Гаосюн ветеранов госпиталь Тайнань филиал.
Сноски
Конкурирующие интересы
Авторы декларируют, что они не имеют конкурирующие интересы.
Авторов взносов
МДС, ЦСК, и YWS разработан эксперимент; МДС, комсомол, и YWS были проведены эксперименты, проанализированы данные и написал рукопись. Все авторы критически рассмотрели рукопись. Все авторы одобрили окончательный вариант рукописи и согласился отвечать за все аспекты работы.
Данные Автора
Минг-Ши-дер, по электронной почте: .
Чэн-Кай Shiao, адрес электронной почты: .
Йи-Цзе ли, написать: .
Юань-Вэй Ши, адрес электронной почты: .
Оставить комментарий