Природа против рака
Известно, что препараты с морфином часто используются для обезболивания при различных злокачественных опухолях. Как оказалось, препараты с морфином стимулируют раковые стволовые клетки и способствуют развитию резистентности к применяемому лечению.
Китайские ученые из Института раковых стволовых клеток Даляньского университета провели ряд исследований по влиянию морфина на раковые клетки молочной железы и пришли к выводу, что использование морфина увеличивает экспрессию (активизацию выработки) транскрипционных факторов Oct4, Sox2 и Nanog, которые связаны с развитием раковых стволовых клеток. Одновременно морфин активирует wnt/β-катенин сигнальный путь, что вызывает активацию мезенхимального перехода и способствует метастазированию. Кроме того, морфин снижает чувствительность к традиционным противоопухолевым лекарствам в клетках рака молочной железы. Налмефен, антагонист морфина, изменяет к лечению химиотерапией при раке молочной железы. Кроме того, налмефен отменяет усиление онкогенеза при морфине у мышей.
Ученые также отметили, что морфин способствует расширению популяции раковых стволовых клеток, резистентных к лечению, и способствует росту опухоли.
ИССЛЕДОВАНИЕ (перевод без адаптации)
Авторы: Институт раковых стволовых клеток Даляньского университета, Китай
Дата: февраль 2015
Источник: www.ncbi.nlm.nih.gov
Рак молочной железы является наиболее распространенным видом рака среди женщин во всем мире [1]. Рак молочной железы содержится субпопуляция самовозобновления клеток, которые напоминают молочных стволовых клеток. Рак молочной железы стволовых клеток (BCSCs) впервые выделен за счет поверхностных маркеров CD44+/CD24−/низкий обладают характерными неограниченное самообновления и способны генерировать дифференцированные потомки [2]. Прививка небольшое количество CD44+/CD24−/низкий клеткам рака молочной железы у NOD/scid для мыши можем повторить фенотипической неоднородности родительской опухоли, а клетки не хватает CD44+/CD24−/низкий маркер есть значительно снижается тумор-формируя способность [3]. BCSCs более устойчивы к традиционной химиотерапии, чем у некурящих BCSCs [4]. В химиорезистентных из BCSCs жестко регулируется следующими механизмами: 1. высота АВС транспортеров, что функция оттока химиотерапевтических препаратов [5]; 2. дифференциация способность ЦОК для регенерации гетерогенных раковых клеток [6, 7]; 3. обогащение ЦОК в ходе терапевтического вмешательства может внести свой вклад в генез ЦОК и увеличить долю ЦОК [8]. Таким образом, ориентированные ЦОК является актуальной задачей для развития противоопухолевого лечения. Однако, молекулярные механизмы, посредством которых ЦОК вклад в сопротивление снадобья будут определены позднее.
Эпителиальные чтобы мезенхимальный переход (ЕМТ) является трансдифференцировки программа, которая изначально признается как ключевой шаг морфогенеза в процессе эмбрионального развития [9]. Последнее время указывает на то, что ЕМТ играет важную роль в развитии лекарственной резистентности при раке молочной железы. Повышенной экспрессии Е-кадгерина увеличивает чувствительность РСКФ битор киназы и препарат резистентных клеток оказываются более мезенхимальные-как признака [10]. Кроме того, медики также участвует в паклитаксел-устойчивость клеток рака молочной железы. Соответственно резистентных клеток дисплей ЭМТ характеристики и увеличить инвазии и миграции [11].
Опиоиды, такие как морфин, являются наиболее сильнодействующими анальгетиками, которые широко используются для анестезии предварительно препарат и управления боли рака с метастазами. В настоящее время, как морфин и противоопухолевые препараты одновременно было дано пациенты, особенно пациенты с раком с метастазами. Однако, новые данные показали, что морфин был дополнительный обезболивающий эффекты, которые появились для изменения прогрессии опухоли путем активации неклассической сигнализации опиоидных рецепторов. Морфин вызывает фосфорилирование рецептора эпидермального фактора роста (РЭФР) через опиоидные рецепторы, способствует пролиферации клеток, увеличение клеток вторжения [12]. Морфин также активирует Марк/ЭРК фосфорилирования через видеорегистратор ptx-чувствительный GPCRs и нет, что приводит к поощрению роста опухоли при раке молочной железы [13]. Кроме того, морфин способствует развитию рака молочной железы клеточной миграции и инвазии за счет увеличения экспрессии НЕТ1 [14]. До сих пор мало внимания уделялось развитию лекарственной устойчивости при применении морфина.
Таким образом, основной целью данного исследования было-выяснить, действительно ли морфин играет важную роль в регулировании раковые стволовые клетки свойства, которые были тесно связаны с химиорезистентных опухолевых клеток и опухоли на злокачественность. В настоящем исследовании, мы обнаружили, что применение морфина в mcf-7 и BT549 клетками, обогащенными раковых стволовых клеточных популяций и способствовали развитию химиорезистентных. Мы также обнаружили, что морфин усиливается tumorigenicity клеток рака молочной железы, который может быть заблокирован, а также многое другое в НОД/модель мыши ИММУНОДЕФИЦИТ. Наше исследование также показало, что морфин способствовали приобретенные химиорезистентных при раке молочной железы. Эти результаты выявлены возможные побочные эффекты морфина в развитии рака и химиорезистентных, которые могут предоставить некоторые Гиды клинического применения морфина.
Результаты
Морфин стимулирует раковые стволовые клетки свойства
Чтобы исследовать потенциальную роль морфина в продвижении раковые стволовые клетки свойства, мы выбрали mcf-7 и BT549 клеточных линий, которые включают в себя относительно низкая численность популяции раковых стволовых клеток [20, 21]. Мы обратились mammosphere формирование анализа и боковых населения пробирного в клетках молочной железы. Mammosphere формирование анализа была использована в качестве суррогата репортер клеточной активности в тканях молочной железы [22] и рак стволовых клеток активность [23]. Мы обращались с МСF-7, BT549 и mcf-10А клетки с морфином (0, 1, 10 мкм), и проведенные в сфере формирования анализа [24, 25]. Результаты показали, что морфин значительно увеличилось сфере размер и количество в обоих клетками mcf-7 (Рис. (Figure1A)1А) и BT549 клеток (Рис. (Figure1B).1Б). Аналогичные результаты были отмечены в нон-преобразование молочной эпителиальных клеток МСF-10А (Рис. (Figure1C).1С). На сторону населения анализа, мы предварительно клетками mcf-7 с помощью морфина (10 мкм) в течение 14 дней, пассированных клеток свежей средой, содержащей морфин каждые 2 дня и проводили населением анализа в сочетании с анализом проточной цитометрии. Наши результаты показали, что стороны населения доля увеличилась с 0,63 ± 0.30% до 3,4 ± 0.15% по сравнению с нелеченной группой в клетками mcf-7 (Рис. (Figure1D).1Д). С CD44+/CD24− широко использовались в качестве клеточной поверхности маркера ЦОК, мы рядом обнаружены экспрессия CD44+/CD24− в раковые клетки молочной железы получавших морфин (10 мкм) и обнаружили, что CD44+/CD24− пропорции были увеличены с 47,87 ± 1.01% до 68,8 ± 2.68% в BT549 клеток (Рис. (Figure1E).1е). Эти результаты демонстрируют, что морфин увеличивает tumorsphere-формирование способности и обогащает раковых стволовых клеток, указывая, что морфин усиливает обновление клеток рака молочной железы и нормальной молочной эпителиальных клеток.
Морфин повышает экспрессию Sox2, Oct4 и Nanog
Sox2, Oct4 и Nanog являются факторы транскрипции, которые играют ключевую роль в поддержании плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток [26–28]. Изучить основной механизм, на который морфина повышает уровень свойств КБК клеток рака молочной железы, мы исследовали экспрессию Sox2, Oct4 и Nanog после лечения морфина. Во-первых, мы исследовали уровень мРНК Oct4, Sox2 и Nanog в mcf-7 и клеток BT549 получавших морфин исполнителя Q-ПЦР. Морфин существенно повысило уровень мРНК Oct4, Sox2 и Nanog в обоих mcf-7 и BT549 клеток. По сравнению с необработанной управления, уровни мРНК Oct4, Sox2 и Nanog были увеличены соответственно на ± 13.08 2.29, 10.57 ± 1.42 а 19,18 ± 0.85 складки в клетками mcf-7 (Рис. (Figure2A),2А), а 6.15 ± 0.61, 10.37 ± 0,91 и 14.92 ± 1.47 складки в BT549 клеток (Рис. (Figure2B).2Б). Последовательно, вестерн-блот анализа показали, что морфин зависит от дозы увеличили уровни белка Oct4, Sox2, Nanog в циркуляции mcf-7 (Рис. (Figure2C)2С) и BT549 клеток (Рис. (Figure2D).2Д). Эти данные позволяют предположить, что морфин может способствовать развитию рака стволовых клеток свойства до регулирующего Oct4, Sox2 и Nanog.
Морфин способствует emt и метастазы
Emt часто сопровождается ростом раковых стволовых клеток [29, 30]. Далее мы изучили, насколько морфина была связана с индукцией emt и метастазирования опухоли. Мы провели оценку экспрессии эпителиального маркера Е-кадгерина и маркеров мезенхимальных N-кадгерина в mcf-7 и BT549 клеток с помощью М-ПЦР, вестерн-блот и immunofluorence окрашивания. Морфий год мРНК уровень CDH1 но увеличение мРНК уровнях CDH2 и CTNNB1 в обе циркуляции mcf-7 (Рис. (Figure3A)3А) и BT549 (Рис. (Figure3B)3Б) клеток. Последовательно, морфина понижается экспрессия Е-кадгерина но увеличена экспрессия N-кадгерина и β-катенина в циркуляции mcf-7 (Рис. (Figure3C)3С) и BT549 (Рис. (Figure3D)3Д) клеток. Кроме того, immunofluorence окрашивание результаты также показали, что морфин понижается экспрессия Е-кадгерина в то время как повышенная экспрессия N-кадгерина и β-катенина в обе циркуляции mcf-7 (Рис. (Figure3E)3е) и BT549 (Рис. (Figure3F)3ф) клеток. Кроме того, мы исследовали экспрессию β-катенина в cytoplasma и ядра индивидуально для wnt/β-катенин активации. Результаты показали, что β-катенин увеличил экспрессию в ядре, а не в cytoplasma в обе циркуляции mcf-7 (Рис.(Figure3G)3Г) и BT549 (Рис. (Figure3H)3ч) клеток. Между тем, как ЕМТ является ключевым процессом в метастаз рака [31], мы рассмотрели роль морфина в опухолевых метастазов по transwell анализа. Результаты показали, что морфин может существенно увеличивать клеточную миграцию и инвазию способности в BT549 клетки (Рис. (Figure3I).3И). Эти результаты позволяют предположить, что морфин повышает emt и метастазы при раке молочной железы.
Морфин вызывает сопротивление доксорубицин и паклитаксел
Продвижение боковой доля населения говорит о том, что морфин может оказывать химиорезистентных. Чтобы продемонстрировать эту гипотезу, мы, во-первых, лечить mcf-7 и BT549 клеток с увеличением концентрации доксорубицина или паклитаксел и анализировали жизнеспособность клеток с помощью МТТ-теста через 24 и 48 часов. Как доксорубицин и паклитаксел год пролиферацию клеток в дозе зависимой манере mcf-7 и BT549 клеток (Рисунок С1). Далее мы исследовали, может ли морфин был в состоянии уменьшить чувствительность BT549 клеток к химиотерапии. Клетки были предварительно обработаны с морфином в течение 4 дней, затем по инкубации с доксорубицином (0,5 мкм) или паклитаксел (10 нм) в течение 2 дней. Наши результаты показали, что морфин (1 мкм или 10 мкм) в одиночку не видимо изменению жизнеспособности клеток, но значительно отменили потерю жизнеспособности клеток, индуцированной доксорубицином (Рис. (Figure4A)4А) или паклитаксел (Рис. (Figure4B).4Б). Далее мы проанализировали влияние морфина на доксорубицин паклитаксел или индуцированного апоптоза в клетках рака молочной железы путем оценки расщепляется parp и каспазы-3 с помощью вестерн-блотинга. Наши результаты показали, что доксорубицин (Рис. (Figure4C)4С) или паклитаксел (Рис. (Figure4D)4Д) индуцированное расщепление parp и каспазы-3, но, видимо, были восстановлены с помощью морфия. Кроме того, лечение BT549 клеток с доксорубицином (Рис. (Figure4E)4е) или паклитаксел (Рис. (Figure4F)4Ф) в результате апоптоза клеток, что, также, видимо, оправился от морфина. Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что морфин вызывает сопротивление доксорубицина и паклитаксела в клетках рака молочной железы.
Налмефен переворачивает морфин от рака, вызванного свойств стволовых клеток и химиорезистентных
Чтобы расширить наши наблюдения, мы также использовали налмефен, антагонист морфина, чтобы проверить, может ли она обратной функции морфина в химиорезистентных. Налмефен в одиночку не оказало существенного влияния на пролиферацию клеток, а в сочетании с морфином и налмефен не спасти клеточной гибели, вызванной доксорубицином или паклитаксел (Рис. 5А–5Б). По сравнению с морфином или паклитаксела с доксорубицином, сочетание с морфином, налмефен и doxorbicin (или паклитаксела) увеличивается расщепление parp и каспазы-3. В контрасте, сочетая морфина с противоопухолевыми препаратами снизилось расщепление parp и каспазы-3 в сравнении с доксорубицином или паклитаксел в покое (Рис. 5С–5Д). Кроме того, по сравнению с морфином в одиночку, налмефен плюс морфина увеличивается апоптоз норма, вызванная доксорубицином или паклитаксел (Рис. 5е–5е). Кроме того, налмефен в одиночку не оказало существенного влияния на способность sphereformation. Тем не менее, лечение препаратом налмефен и морфий привела в итоге к снижению сфере числа и диаметров по сравнению с морфином в покое (Рис. (Figure5G).5г). Взятые вместе, эти результаты показывают, что налмефен может дать обратный эффект морфина в обоих формируя сфере способность и химиорезистентных.
Налмефен переворачивает морфин-увеличение опухолей
Расследовать ли морфин может способствовать развитию рака, и эффект может быть заблокирован, а также многое другое в естественных условиях, мы создали НОД/scid для мыши модели. BT549 клетки подкожно вводили мышам и после лечения как уже упоминалось. Как мы и ожидали, не было обнаружено значимых различий в росте опухоли между физиологическим раствором контрольной группы и группы, а также многое другое, в котором указано, что налмефен оказывает незначительное влияние на рост опухоли. По сравнению с обычной солевой группы, группы морфин показал помете больший объем опухоли на 21-й день и в 2,1 раза больше объема опухоли в день 36 (Рис. 6А–6Б). В отличие от морфина плюс налмефен группа продемонстрировала снижение роста опухоли на 24 день и 2.0 раза меньше объема опухоли на 42-й день в сравнении с морфином группы (Рис. 6А–6Б). Всех мышей, которым вводили морфин (все 10) образовались опухоли, в то время как 3 из 10 мышей, которым вводили физиологический или налмефен не форма опухоли (Рис.(Figure6C).6с). Эти результаты указывают на то, что морфин повышает опухолей, который может быть отменено, а также многое другое.
Обсуждение
Большинство больных раком молочной железы использовать морфин для облегчения сильной боли. Однако, морфин способствует пролиферации, инвазии и метастазирования раковых клеток, предполагая, что долгосрочное использование морфия может представить некоторый побочный эффект на рак молочной железы пациентов, которые получают химиотерапию. В этом исследовании, мы обнаруживаем, что морфин может увеличиться mammosphere формирование способности и обогатить стволовые раковые клетки населения МСF-7, BT549 и mcf-10А клетки (Рис. (рис. 1),1), сопровождается увеличением экспрессии клеточных генов, связанных с в груди человека раковые клетки (Рис. (Figure2).2). Тем временем морфин способствует emt и метастазы при раке молочной железы клетки (Рис. (Figure3).3). Кроме того, долгосрочное использование морфина приводит к устойчивости клеток рака молочной железы к паклитаксела и доксорубицина (Рис. (Figure4).4). Кроме того, налмефен может дать обратный эффект морфина на рак молочной железы стволовых клеток доли, химиорезистентных (Рис. (рисунком 5)5) и опухолей (Рис. (Figure66).
Предыдущее исследование показало, что морфин показан противоопухолевой активностью и ингибирует активацию ядерного фактора транскрипции ĸB (НФ-ĸB) [32]. Морфин снижает пролиферацию клеток во многих человеческих раковых клеток, включая рак молочной железы, рак легких, рак желудка и рак предстательной железы [33–36]. Кроме того, морфин вызывает г1 арест клеточного цикла и апоптоз, стимулируя фосфорилирование р53 по сер9 и/или ser15 [37]. Кроме того, долгосрочное использование морфина для мышей с пересаженными нейробластома опухоли ингибирует рост опухоли и продлевает время выживания, которое может быть отменено антагониста морфина, налоксона [38, 39]. Мы предположили, что различия могут быть результатом различных доз морфина достигнута, путь введения, и/или доз плазмы в устойчивом состоянии.
Многочисленные исследования показали, что приобретенной резистентности может быть связано с наличием ЦОК [30, 40]. Например, фосфорилированного STAT3 способствовало стебель-как фенотип клеток в her2-экспрессирующих клеток рака молочной железы, который был устойчив к Герцептин [41]. Аналогично, miR125 поддерживается раковых стволовых части населения фракции, которая была выше выражение в химиотерапии у пациентов, резистентных к химиотерапии, чем в отзывчивых пациентов [42]. В соответствии, наше исследование показало морфин способствовало стебель-как фенотип клеток и индуцированной ЕМТ, которые могли бы способствовать химиорезистентных.
Стволовых клеток маркеры Sox2, Oct4 и Nanog играть ключевую роль в развития рака и лекарственной устойчивости [43]. Наши результаты показывают, что морфин значительно выросли эти маркеры стволовых клеток, поддерживая придумку что долгосрочное использование морфина приводит к обогащению свойств стволовых клеток и лекарственной устойчивости.
ЕМТ, характеризующееся потерей дифференциации эпителиальных и мезенхимальных приобретают фенотип, в сопровождении метастазирования и лекарственной устойчивости, тесно связана с биологией ЦОК [44]. Недавние исследования показали, что индукция увековечили человека молочных эпителиальных клеток в мезенхимальные фенотип, в результате чего потери эпителиального фенотипа и приобретение фенотипа мезенхимальных, одновременно с приобретением CD44+/CD24−/низкий шаблон выражения [45]. Другой отчет отметил, что индукции ЕМТ по СД8+ Т-клеток привела к разрастанию опухоли в естественных условиях. Интересно, что мезенхимальные опухоли клеток CD44+/CD24−/низкий фенотип может восстановить эпителиальная опухоль и проявляют устойчивость к лекарственным препаратам, которые напоминали признаки грудного ЦОК [46]. В нашем исследовании, морфин индуцированной ЕМТ путем повышения экспрессии ядерного β-катенина и поощрять метастазирование клеток рака молочной железы. Вместе взятые, эти отчеты и наши исследования убедительно свидетельствуют, что индукция ЭМТ может генерировать стволовые клетки, как.
Налмефен, опиатов, производных, похожее на опиатного антагониста налтрексона в структуре и деятельности, которая ориентирована на МЮ-, Дельта-и каппа-сайтов связывания [47–49]. В настоящем исследовании, мы обнаружили, что налмефен может дать обратный эффект морфина в продвижении stemness рака молочной железы и химиорезистентных доксорубицина и паклитаксела. В нашем исследовании, налмефен (10 мкм) в одиночку не было никакого эффекта на рост клеток, апоптоз и области-формирование способности (Рис. (рисунком 5).5). Кроме того, доклинические и клинические исследования показали, что совместное лечение с очень малых доз опиоидных антагонистов рецепторов может значительно повысить эффективность и специфичность морфина и одновременно ослабить опиоидной толерантности и зависимости [50]. Таким образом, в комбинации с морфином и низкая дозировка, а также многое другое будет более эффективным в лечении рака без увеличения лекарственной устойчивости и агрессивности.
В заключение, мы обнаружили прямого влияния морфина на вызывающие раковые стволовые клетки свойства и химиорезистентных при раке молочной железы. Наши данные показали, что морфий привела к химиорезистентных доксорубицина и паклитаксела. Таким образом, мы предполагаем, что сочетание с морфином и налмефен повышения эффективности противоопухолевого лечения. Тем не менее, необходимы дополнительные клинические исследования, чтобы расширить наши наблюдения и потенциальный механизм находится под проводит в нашей лаборатории.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клеточные линии и культуры клеток
Рак молочной железы человека линии клеток МСF-7, BT549 и увековечил эпителиальных клеток молочной железы МСF-10А были получены из американской коллекции культуры (АИКТ). Клеточные линии были проверены на АИКТ прежде чем купить стандартные короткого тандемного повтора ДНК типирование методологии. Mcf-7 и BT549 клеток обычно сохраняется в высокой глюкозы в среду dmem (Gibco) и RPMI1640 (Gibco) с добавлением 10% ФБС, соответственно. ФВТ-10А клетки культивировали в среду dmem/F12 в средней (Invitrogenбыл) с добавкой 5% (В/В) лошадиную сыворотку (ГС, HyClone), 20 нг/мл ЭФР, 100 нг/мл холерного токсина, 0,01 мг/мл инсулина и 500 нг/мл гидрокортизона.
Препараты и реагенты
Морфина гидрохлорид был от Северо-Восточного фармацевтического концерна (Китай). Налмефен гидрохлорид был от Haisike (Китай). Хехст 33342 (Сигма) растворяют в DH20 В наличии концентрацией 5 мг/мл и хранят при температуре -20°C. Fumitremorgin с (КДТ), приобретенных от Sigma растворяли в ДМСО до концентрации акций 2 мм и хранят при -20°С. Doxrubicin был приобретен KeyGene (Китай). Паклитаксел (Технология клеточной сигнализации) растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентрации штока на 1 мм и хранить при -20°C.
МТТ-теста
МТТ (Сигма) анализ был использован для оценки роста клеток рака молочной железы. Клеток (2.5–5 × 103) высевают в 96-луночный плоское дно плиты в до конечного объема 200 мкл. При подключении к квартира, клетки подверглись действию к наркотикам в течение 24 до 48 часов. Выживание клеток оценивали, как описано ранее [15].
Иммунофлуоресцентное окрашивание
Иммунофлуоресценции окрашивание клеток проводили, как описано ранее [16]. Кратко, клетки фиксировали в 4% пара-формальдегида на pbs при комнатной температуре в течение 20 минут и permeabilized в 0,5% Тритон х-100 в pbs в течение 10 минут при 4°C. клетки были тогда заблокированы с 3% БСА и инкубировали с первичными антителами против Е-кадгерина (клеточных сигнальных технологий), N-кадгерин (компании abcam) и β-катенина (Канаде) с последующим ДИТЦ конъюгированного второго антитела (Invitrogenбыл), counterstained с окраска dapi (1 мкг/мл) и визуализировали с помощью конфокального микроскопа (Leica с).
Миграция Transwell и анализы вторжения
Для анализа миграции клеток (5 × 104) предварительно морфин (0, 1, 10 мкм) в течение 4 дней были снова суспендируют в питательной среде с одной и той же концентрации морфина и помещены в мембраны без покрытия в верхней камере (24-ну вставьте, 8 мкм, Корнинг Костар). Среду dmem с добавкой 10% ФБС был использован в качестве аттрактанта в нижней палате. После инкубировали в течение 24 часов, клетки мигрировали через мембрану фиксировали с помощью 4% paraformaldehyle (Санта-Крус) и окрашивали 1% кристаллического фиолетового (Шанхайская компания Sangon). Окрашенные ячейки изображения были захвачены микроскоп (Олимп), и насчитали пять случайных полей при 10-кратном увеличении. Результаты представляют средние образцы трех экземплярах из трех независимых экспериментов.
Для вторжения анализы, клетки (8 × 104) помещали в 50 мкл матригель (BD биотехнологии) с покрытием мембраны в верхней палате и в процессе инкубации в течение 36 часов. Следующие действия были схожи с миграцией анализы.
Апоптоз анализа
Клетки обрабатывали указанными концентрациями морфина, доксорубицин (или паклитаксела) и налмефен, с последующим окрашиванием с Аннексина V и Pi в течение 15 минут при 4°C в темноте. Апоптотических клеток определяли по Аннексин V/ДИТЦ выявления апоптоза комплекте (кейген KGA108, Китай) и Accuri C6 в проточный цитометр в соответствии с инструкциями производителя.
Обнаружение рака молочной железы поверхностный маркер CD44/CD24
Для оценки CD24 и CD44 выражение, клетки культивировали с морфином (10 мкм) в течение 14 дней. Клетки (2 × 106) собирали и инкубировали с антителами к CD44 ДИТЦ (от BD Pharmingen) и CD24 PerCP-Су5.5 (от BD Pharmingen) в течение 30 минут при 4°C в темноте. Несвязанные антитела смылся через два цикла промывки с pbs. Затем клетки анализировали на системе управления БД Калибур проточный цитометр. Эти данные были проанализированы по Cellquest Pro и не менее 20000 событий в примере были собраны.
Стороны населения пробирного
Клетками mcf-7 (106/мл) инкубировали с 2 мкм КДК, ABCG2-специфическим ингибитором, в течение 20 минут в отрицательный контроль труб перед добавлением Хехст 33342. Затем клетками mcf-7 инкубировали в сбалансированные солевые растворы Хэнкса (HBSS) с добавлением 2% ФБС, 10 мм HEPES, 5 мкг/мл Хехст 33342 в течение 90 минут при 37°C с периодическим перемешивания с последующей промывкой холодной среде. Клетки были снова суспендируют в 2×106 клеток/мл. ПИ был добавлен в конечной концентрации 2 мкг/мл различать мертвые клетки. Стробирование стороны населения было основано на отрицательных контролей, в котором КДК был использован. Затем клетки анализировали на FACScalibur BD и проточный цитометр. По крайней мере, 100 000 событий в выборке были собраны для анализа данных.
Количественные обратной транскриптазы полимеразной цепной реакции
Тотальную РНК экстрагировали с использованием реагента TRIzol (Invitrogenбыл), который был использован для генерирования кднк с помощью Надстрочный III в РТ (Invitrogenбыл) с олиго-ДТ грунт. Вопрос-ПЦР проводили с использованием платины SYBR зеленый количественная ПЦР Супермикс (Invitrogenбыл) в соответствии с рекомендациями производителя. Праймеры были использованы, перечисленных в дополнительной таблице 1. ACTB был использован в качестве внутреннего контроля.
Формирование сферы анализа
Формирование сферы была проведена в сверхнизких крепления пластин (Корнинг) со средним дополнен 2% B27, 20 нг/мл симптомов нижних половых путей, и 20 нг/мл ЭФР. BT549 и MCF7 клетки были посажены при плотности около 2 клеток/мкл и культивировали при 37°С В 5% со2. После 14 дней, сфер больше, чем диаметр 50 мкм подсчитывали при 40-кратном увеличении под микроскопом Олимп. Эффективность формирования сферы (СФЭ) = Количество сфер на 1000 клеток.
Вестерн-блот
Клетки (1 × 106) отмывали ледяным pbs и разрушенные рипы в лизис буфере на льду. Клетки (1 × 107) подверглись ядерных/цитоплазматических изоляции белков с помощью ядерного/Цитозоле Фракционирования комплект (Biovision K266–25). Равное количество белков разделяли SDS-пааг и переносили на мембраны НК. Мембраны были заблокированы с 5% обезжиренного молока в TBST при комнатной температуре в течение 1 часа и исследовали с первичными антителами против Oct4, ПАРП, каспазы-3 (клеточных сигнальных технологий), Nanog (компании abcam), Sox2 (Санта-Крус), Е-кадгерин (Epitomics), N-кадгерин (компании abcam), β-актина (Proteintech), Ламин В1 (Epitomics) и β-катенина (Канаде) при 4°C в течение ночи, с последующим инкубации с соответствующими вторичными антителами (термо) при комнатной температуре в течение 60 минут. Связывание антител была обнаружена с помощью усиленной хемилюминесценции комплект (Амершам, Великобритания). Относительные величины были отмечены изображения программного обеспечения лаборатории 4.0.1 (Био-рад компании).
Мыши ксенотрансплантата анализа
BT549 клеток (6 × 106) в 100 мкл, подкожно вводят по правой дорсальной фланг самок мышей (4-6 неделя, 18-25 г, г. Далянь, Китай). Мышей лечили ежедневно подкожно с физраствором (п = 5), налмефен (п = 5), морфин (п = 5), или налмефен плюс морфин (н = 5) сразу после имплантации опухолевых клеток. Из-за потенциального десенситизацию опиоидных рецепторов, дозу морфия и налмефен повышались ступенчато (5, 10 и 15 мг/кг s.гр. для каждые две недели). Для лекарственной комбинации, а также многое другое доза составляла одну десятую от морфина дозу, потому что это соотношение, как правило, считается, чтобы привести в полный антагонизм антиноцицептивный эффекты морфина [17]. Вес тела животных и двух перпендикулярных диаметров (A и B) были записаны каждые 3 дня. Объем опухоли (V) был рассчитан по следующей формуле: V = (А*Б*В)/2 [18]. Сорок два дня после инъекции хвостовой внутривенно, у мышей забивали и вскрывали. Протокол был выполнен, как описано ранее [19]. Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике животных Далянь медицинского университета.
Статистический анализ
Каждый эксперимент проводили в трех экземплярах и повторять не менее трех раз. Различия в средних значениях между группами оценивали и выражали как среднее ± SD. А Р-значение меньше 0,05 считалось статистически значимы (*Р < 0.05, **Р < 0.01, ***Р < 0.001). Студента т-тест был использован для сравнения выражений клеточных поверхностных маркеров, бортовой населения анализ жизнеспособности клеток относительных уровней мРНК, мигрировавших клеток и вторгся в клетки. Критерий Манна-Уитни использовался для сравнения объемов сфере. В anova-тест был использован для сравнения объем опухоли.
Благодарности
Это исследование было поддержано за счет средств Национальной программы фундаментальных исследований Китая (программа 973: нет.2012CB967000 на Ц. Лю), Национальный Фонд естественных наук Китая (не. 81273923 в Wqp) (нет.81130040 на Ц. Лю), программы для ученых Янцзы и инновационных исследований группа ученых из Университета (IRT13049 на Ц. Лю), Ляонин НФС 2014029102. Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Квентин Лю за критические замечания и техническую поддержку.
Глоссарий
Аббревиатуры
| BCSCs | Груди раковых стволовых клеток |
| ЦОК | Раковые стволовые клетки |
| ЕМТ | Эпителиальных в мезенхимальные перехода |
| КДК | Fumitremorgin С |
| Мор | Морфин |
| Налог | Паклитаксел |
| Дох | Доксорубицин |
| Нал | Налмефен |
| ПАРП | Поли-АДФ-рибоза-полимеразы |
| ПИ | Йодид пропидия |
| ABCG2 | АТФ-связывающие суб-семейные кассеты г член 2 |
Сноски
Конфликт интересов
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие интересы.
Ссылки
Оставить комментарий